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液相色譜儀的基本概念和術語(二)

更新時間:2011-04-19      點擊次數:4600

三、柱效參數

⑴理論塔板數(theoretical plate number,N)用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效)。
    N取決于固定相的種類、性質(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布,N可近似表示為:
N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2
W:峰寬 ; σ:曲線拐點處峰寬的一半,即峰高0.607處峰寬的一半。
N為常量時,W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上,如果各組份含量相當,則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬,峰高則逐漸降低。
    用半峰寬計算理論塔板數比用峰寬計算更為方便和常用,因為半峰寬更容易準確測定,尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比,柱越長,N越大。用N表示柱效時應注明柱長,,如果未注明,則表示柱長為1米時的理論塔板數。(一般HPLC柱的N在1000以上。)
若用調整保留時間(tR’)計算理論塔板數,所得值稱為有效理論塔板數(N有效或Neff)=16(tR’/W)2

⑵理論塔板高度(theortical plate height,H)每單位柱長的方差。H=。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算:H=L/N

四、相平衡參數(distribution coefficient,K)
    在一定溫度下,化合物在兩相間達到分配平衡時,在固定相與流動相中的濃度之比。K=[xs]/[xm]
Cs-溶質在固定相中的濃度 Cm-溶劑在流動相中的濃度
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關,也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中,K有不同的概念:吸附色譜法為吸附系數,離子交換色譜法為選擇性系數(或稱交換系數),凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
    在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定,樣品濃度很低時(Cs 、Cm很小)時,K只取決于組分的性質,而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件,在這種條件下,得到的色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度的增大,K減少,這時色譜峰為拖尾峰;而有時隨著溶質濃度的增大,K也增大,這時色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能較少進樣量,使組份在柱內濃度降低,K恒定時,才能獲得正常峰。
    在同一色譜條件下,樣品中K值大的組份在固定相中滯留時間長,后流出色譜柱;K值小的組份則滯留時間短,先流出色譜柱。混合物中各組份的分配系數相差越大,越容易分離,因此,混合物中各組份的分配系數不同是色譜分離的前提。
    在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及PH值,以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間,達到分離的目的。

1、容量因子(capacity factor,K)--化合物在兩相間達到平衡時,在固定相與流動相中的量之比。K=(tR-t0)/t0=tR’/t0(或溶質在固定相中的量/溶質在流動相中的量)。因此,容量因子也稱質量分配系數。
{K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs:色譜柱中固定相的體積; Vm:色譜柱中流動相的體積。}
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系:k===K=,tR’=kt0。上式說明容量因子的物理意義:表示一個組份在固定相中停留的時間(tR’)是不保留組分保留時間(t0)的幾倍。k=0時,化合物全部存在與流動相中,在固定相中不保留,tR’=0;k越大,說明固定相對此組分的容量越大,出柱慢,保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是:K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度,而與體積Vs、Vm無關;k除了與性質及溫度有關外,還與Vs、Vm有關。由于tR’、t0較Vs、Vm易于測定,所以容量因子比分配系數應用更廣泛。

2、選擇性因子(selectivity factor,α)--相鄰兩組份的分配系數或容量因子之比。α==(設k2>k1)。因k=tR’/t0,則α=k2/k1,所以α又稱為相對保留時間(《美國藥典》)。
要使兩組分得到分離,必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關,與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說,α的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異,即分子間相互作用力的差異。

五、分離參數

1、分離度(resolution,R)--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率,表示相鄰兩峰的分離程度。R=(tR2-tR1)/[(W1+W2)/2],當W1=W2時,R=。當R=1時,稱為4σ分離,兩峰基本分離,裸露鋒面積為95.4%,內測峰基重疊約2%。R=1.5時,稱為6σ分離,裸露鋒面積為99.7%。R≥1.5稱為*分離。《中國藥典》規定R應大于1.5。

2、基本分離方程――分離度與三個色譜基本參數有如下關系:
R=1/4(а-1)×N0.5×[k’/(1+k’)]
其中N稱為柱效項,α為柱選擇項,k’為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關,后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方常可看出,提高分離度有三種途徑:①增加塔板數。方法之一是增加柱長,但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度,提高柱效。②增加選擇性。當α=1時,R=0,無論柱效有多高,組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性:a.改變流動相的組成及PH值;b.改變柱溫;c.改變固定相。③改變容量因子。這常常是提高分離度的zui容易方法,可以通過調節流動相的組成來實現。k2趨于0時,R也趨于0;k2增大,R也增大。但k2 不能太大,否則不但分離時間延長,而且峰形變寬,會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2 在1~10范圍內,為2~5,窄徑柱可更小些。


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