膽汁酸被認為是一類重要的生物標志物，或者被認為可在代謝性疾病的治療中發揮作用。由于膽汁酸存在多種異構體以及檢測方法靈敏度的限制，同時進行多種膽汁酸定量分析的工作仍是一個挑戰。島津中國創新中心與北京大學第三醫院藥物臨床試驗機構劉東陽研究員課題組合作開發一種準確、靈敏的液相色譜三重四極桿串聯質譜法（LC-MS/MS），以進行多種極性相近膽汁酸的同時定量檢測。通過將開發的定量分析進一步應用于健康人群血漿樣本的測試，對其中35個膽汁酸進行定量分析，用以觀察葡萄糖攝入后血漿中膽汁酸的動態分布特征。相關成果以“Isomers-oriented separation of forty-five plasma bile acids with liquid chromatography-tandem mass spectrometry"為題，發表在化學期刊《Journal of Chromatography A》(doi.org/10.1016/j.chroma.2024.464827)

背景介紹

本研究建立了LC-MS/MS同時定量人體血漿樣品中45種膽汁酸的分析方法。該方法以異構體分離為導向，使用9種穩定同位素內標，經過對色譜及質譜條件的優化后，可同時準確定量分析45種膽汁酸的人體血漿濃度，并保證均獲得0.05-10 ng/mL的定量下限。系統適用性、線性相關系數、可靠性、準確度和精密度等相關結果，均滿足方法學要求，本研究所建立的質譜定量方法具有較高的靈敏度和更高的分離能力。

實驗條件：

本工作使用島津液相色譜-三重四極桿串聯質譜LCMS-8060NX進行方法開發、驗證及實驗樣品檢測。

LC分離參數：

流動相A：水+0.01%甲酸；流動相B：乙腈+0.01%甲酸

色譜柱：ACE EXCEL 1.7 C18 (2.1mm*100mm, 1.7μm)

流速：0.25mL/min

柱溫：45℃

進樣量：3μL

質譜檢測參數：

離子化模式：ESI，負離子模式；霧化氣：2L/min;干燥氣：10L/min; 加熱氣：10L/min; 接口溫度：300℃；

脫溶劑管線DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃。

實驗結果

圖2顯示45種目標膽汁酸及9種內標的MRM離子流圖，各化合物得到良好分離，且無明顯干擾。對該方法進行方法學驗證，獲得良好的系統適用性、基質效應、殘留效應、稀釋可靠性、準確度、精密度、線性及穩定性結果，證明分析方法的可靠性。

對進行靜脈葡萄糖耐量試驗（IVGTT）的12個健康中國志愿者在不同時間點(基線區間及攝入葡萄糖后，0-240min)采集的共180個血漿樣品進行檢測。共計35種膽汁酸被檢出，其中27種符合定量分析標準要求(在超過2/3的個體樣品中可被準確定量分析)。代表性膽汁酸的濃度-時間變化曲線如圖3所示。根據檢測結果，在進行糖分攝入后，游離型膽汁酸與結合型膽汁酸顯示不同的變化規律。游離型膽汁酸濃度在整個實驗過程中持續性下降，而同時結合型膽汁酸會在起始階段先出現下降而后在特定時間點發生反彈，表明存在不同的因素影響兩種類型膽汁酸發生變化。

對比IVGTT過程中膽汁酸濃度-時間曲線與血糖濃度變化趨勢，圖4對比了游離型膽汁酸CDCA、結合型膽汁酸TCA以及總膽汁酸與血糖、胰島素的變化過程。在給予靜脈葡萄糖注射后，游離型膽汁酸與葡萄糖均呈現快速的清除速率，顯示血漿中濃度的快速下降。結合型膽汁酸在注射葡萄糖60min內顯示與游離膽汁酸類似的變化趨勢，但是之后出現濃度的明顯上升。總膽汁酸的變化趨勢與游離型膽汁酸CDCA的變化趨勢更加接近。

小結：

綜上所述，本工作基于島津液相色譜三重四極桿質譜法（LC-MS/MS）建立了同時準確定量生物樣本中45種膽汁酸的分析方法，并將該方法進一步應用于檢測葡萄糖耐受實驗后健康人群血漿中膽汁酸的變化。研究結果表明，膽汁酸、葡萄糖和胰島素的變化之間存在一定的相關性，其具體機制還需進一步研究調查。