摘要】目的建立芫花藥材的液相指紋圖譜分析方法。方法采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6mm×250mm,5μm），甲醇水梯度洗脫，體積流量為1ml/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)332nm，記錄時(shí)間50min。以芫花素為參照物，對(duì)17批樣品進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算相似度。結(jié)果初步建立芫花藥材的指紋圖譜，標(biāo)定7個(gè)共有峰，各產(chǎn)地藥材之間的相似性良好。結(jié)論該方法穩(wěn)定可靠，簡(jiǎn)單可行，能夠提高芫花藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

　　【關(guān)鍵詞】芫花藥材反相液相指紋圖譜相似度

　　芫花為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.etZucc.的干燥花蕾，為傳統(tǒng)的瀉下逐水藥，有毒，具有瀉水逐飲、解毒殺蟲的功效，內(nèi)服用于治療水腫脹滿，胸腹積水，痰飲積聚，氣逆咳喘，二便不利，外用治療疥癬禿瘡，凍瘡。現(xiàn)代研究表明芫花還具有治療慢性支氣管炎、肝炎、妊娠中期引產(chǎn)、抗白血病等作用。

　　芫花中的黃酮類成分（芫花素等）為其鎮(zhèn)咳祛痰、殺蟲的有效成分；二萜原酸酯類成分（芫花酯甲等）是利水、殺蟲的有效成分，也是毒性成分。兩種成分含量測(cè)定方法及含量限度要求已另文發(fā)表。作為多組分的中藥材，僅有某個(gè)有效成分或毒性成分的定性定量研究不足以全面反映芫花藥材質(zhì)量。指紋圖譜在控制多組分成分方面具有整體性和特征性的優(yōu)點(diǎn)。目前尚未見到芫花藥材指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLCDAD法對(duì)其進(jìn)行研究，以芫花素為參照物，測(cè)定17批樣品并計(jì)算相似度，標(biāo)定了7個(gè)共有峰，初步確定了芫花藥材的指紋圖譜，以期為提高該藥材的全面質(zhì)量控制建立一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確有效的方法。

　　1、儀器與試藥

　　依利特P1201液相色譜儀，依利特DAD230+二級(jí)陣列檢測(cè)器。

　　芫花素對(duì)照品為自制，經(jīng)UV，1HNMR，13CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算純度大于98%，符合含量測(cè)定的要求。甲醇為色譜純，水為自制高純水，其余試劑均為分析純。

　　芫花藥材共17批，其中市售品15批，分別購(gòu)自河北安國(guó)（3批）、安徽亳州（2批）、廣西（4批）、河南鄭州（2批），河南登封（3批）、廣州清平（1批）；采集品2批，采自河南信陽(yáng)；經(jīng)原思通研究員鑒定均來源于瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.etZucc.的干燥花蕾或花。

　　2、方法與結(jié)果

　　2.1色譜條件色譜柱為DiamonsilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）。流動(dòng)相為甲醇、水，兩相梯度洗脫，0min，45％甲醇；10min，55％甲醇；20min，65％甲醇；40min，80％甲醇；50min，100％甲醇沖柱30min，然后用45％甲醇平衡柱子30min。體積流量為1ml/min。柱溫為35℃。檢測(cè)波長(zhǎng)332nm。記錄50min的色譜圖。

　　2.2對(duì)照品溶液的制備取芫花素對(duì)照品約0.5mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，每毫升中含芫花素0.0216μg/μl。

　　2.3供試品溶液的制備取各地樣品0.5g，精密稱重，準(zhǔn)確加入甲醇25ml，稱重，超聲10min，待其冷卻至室溫，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過微孔濾膜（0.45μm），即得。

　　2.4樣品測(cè)定精密吸取各樣品的供試品溶液10μl和對(duì)照品溶液5μl，注入液相色譜儀，記錄液相色譜圖。

　　2.5方法學(xué)考察

　　2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)取供試品溶液（第6號(hào)樣品），連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3％，表明儀器性能良好。

　　2.5.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取第6號(hào)樣品5份，制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3％，表明樣品的制備方法穩(wěn)定。

　　2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取第6號(hào)樣品5份，分別在0，2，4，6，8，12h進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3％，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

　　2.6指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)［5］在上述條件下測(cè)定17批樣品，選擇各樣品中共有的7個(gè)色譜峰作為共有峰。以芫花素色譜峰（7，S）為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，分別求出其他各組份的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表1～2。表117批芫花藥材指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間表217批芫花藥材各批樣品中各共有峰的相對(duì)面積

　　2.7相似度評(píng)價(jià)及對(duì)照指紋圖譜的建立采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2000A版）》對(duì)各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件（輸出格式為aia）進(jìn)行分析，自動(dòng)匹配，并以17批樣品生成的對(duì)照譜圖（中位數(shù)法）作為對(duì)照模板，得到芫花對(duì)照藥材的對(duì)照指紋圖譜；計(jì)算各色譜圖的整體相似度均在0.9以上。

　　3、討論

　　3.1流動(dòng)相的確定為獲取足以代表芫花特征的指紋圖譜，在選擇HPLC色譜條件的過程中，曾以甲醇水系統(tǒng)和乙腈水系統(tǒng)為流動(dòng)相，分別進(jìn)行考察，結(jié)果顯示甲醇水系統(tǒng)所得色譜圖基線平穩(wěn)，主要色譜峰均基本達(dá)到基線分離，因此確定以甲醇水系統(tǒng)為流動(dòng)相。

　　3.2檢測(cè)波長(zhǎng)和采集時(shí)間的選擇為了獲得更多的樣品信息，采用光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）全波長(zhǎng)掃描的方法，采集不同波長(zhǎng)下的色譜圖，以332nm下基線平穩(wěn)，且色譜峰數(shù)目較多，各峰的分離度較好，峰高合適，因此確定332nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中記錄了110min的色譜圖，發(fā)現(xiàn)50min以后無色譜峰出現(xiàn)，故確定采集時(shí)間為50min。表317批芫花藥材指紋圖譜相似度結(jié)果

　　3.3提取溶劑的選擇采用多種提取溶劑，如三氯甲烷、乙醇、甲醇作為溶劑進(jìn)行提取，研究中發(fā)現(xiàn)，而三氯甲烷和乙醇中色譜峰數(shù)目較少，且芫花素峰面積較小，說明這兩種試劑對(duì)該藥材中成分的提取效果較差；而甲醇提取液中色譜峰較多，且分離度較好，因此選擇甲醇為提取溶劑。

　　3.4小結(jié)本實(shí)驗(yàn)以HPLCDAD法測(cè)定芫花藥材的指紋圖譜，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，對(duì)于提高該藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所建立的芫花藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜可以作為芫花藥材真?zhèn)舞b別的參考依據(jù)。如果能夠獲得更多代表性的樣品，按照不同產(chǎn)地、不同采收期分別進(jìn)行測(cè)定，比較異同點(diǎn)；或者在樣品制備過程中采用現(xiàn)代方法（如大孔樹脂法等），獲得更多成分的信息，將會(huì)獲得更全面的科學(xué)依據(jù)。芫花藥材主要包括黃酮類成分和二萜原酸酯類成分，兩類成分極性和含量差異較為懸殊，很難在同一色譜圖上顯現(xiàn)各自的成分群。本實(shí)驗(yàn)方法主要對(duì)芫花藥材中的黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)二萜原酸酯類成分群的指紋圖譜研究將需做進(jìn)一步的研究，使芫花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系更為完善。